1. Modifiering av gener relaterade till cellmetabolism
Modifiering av gener relaterade till cellmetabolism: Genfragment relaterade till cellmetabolism introduceras i celler genom genteknik för att förbättra prestandan hos CHO-produktionsceller. Till exempel, genom att överuttrycka glaskroppshemoglobin (VAH), kan produktiviteten för tPA (human vävnadsplasminogenaktivator) ökas med 40% ~ 60%, och därigenom förändra den metaboliska aktiviteten hos CHO-celler, förlänga odlingscykeln och öka produkten avkastning.
2. Modifiering av gener relaterade till apoptos eller proliferation
Att hämma förekomsten av apoptos kan förlänga cellkulturens livslängd, såsom att hämma apoptos genom att överuttrycka BCL2, XIAP, AVEN, FAIM och MCL1. Dessutom är cellapoptos direkt relaterad till förlusten av produktintegritet, eftersom proteaser och andra bearbetningsenzymer från döda celler ackumuleras i odlingsmediet i slutet av odlingen, vilket leder till produktkvalitetsproblem. Därför kan anti-apoptosteknik lösa dessa problem genom att kontrollera de proteaser som frigörs av celler, och därigenom säkerställa att produkten förblir av hög kvalitet i slutet av produktionen.
3. Modifiering av gener relaterade till posttranslationella modifieringar
Även om de rekombinanta proteiner som produceras av CHO-celler har hög säkerhet, visar de endast humanliknande men inte identiska posttranslationella modifieringar (PTM). Eftersom PTM har en viktig inverkan på prestandan hos rekombinanta proteiner, kan felaktig N-glykosyleringsmodifiering leda till allvarliga immunsvar och kan till och med försvaga cytotoxiciteten (ADCC) hos monoklonala antikroppar (mAbs). Glykosyleringstillståndet påverkar allvarligt egenskaperna hos rekombinanta proteiner, såsom serumhalveringstid, stabilitet, immunogenicitet och funktion. Olika målgener involverade i glykosylering har blivit mål för genknockoutstudier för att förbättra glykosyleringsprestandan hos rekombinanta proteiner producerade av CHO-celler.
Med den ökande efterfrågan på komplex glykosylering av rekombinanta proteiner, konstruerade forskare en CHO-cellinje som stabilt överuttryckte ST6GAL 1989. Denna cellinje kan utsöndra rekombinanta proteiner som innehåller -2,6-sialinsyraglykosidrester.
Malphettes et al. använde zinkfingernukleas-teknologi (ZFN) för att stabilt slå ut FUT8-genen från genomet och utvecklade en CHO-cellinje med 8-FUT-brist; de använde ZFN-teknik för att slå ut två olika viktiga kolhydrattransportörer, GDP-fukostransportören (SLC35C1) och sialinsyratransportören (SLC35A1), för att erhålla en konstruerad CHO-cellinje som producerar fukos och sialylerade glykoproteiner, vilket förbättrar den post-translationella modifieringen av CHO-cell rekombinanta proteiner.
4. Gen knockout
Förutom att överuttrycka gynnsamma gener för att förbättra prestandan hos CHO-produktionsceller, ger knockout av ogynnsamma gener också en bättre strategi för värdceller. En mängd olika metoder kan stabilt ta bort en gen från genomet eller inaktivera dess funktion, såsom genom kemiska eller strålningsinducerade slumpmässiga mutationer. Knockout av dihydrofolatreduktasgenen (DHFR) och knockout av den endogena genen GS-genen ökade båda effektiviteten hos CHO-celler som uttrycker antikroppar.
5. Flera knockouts av CHO-genomet med hjälp av CRISPR/Cas9-teknologi
CRISPR/Cas9 har förmågan att exakt redigera genomet, vilket gör genknockout lättare att etablera, mer tidsbesparande och effektivare. CRISPR-systemet är en adaptiv immunförsvarsmekanism som produceras av bakterier och archaea i en process av kontinuerlig evolution, som används för att skydda deras egna genom från interferens och förstörelse av exogena nukleinsyror. Knockout av BCAT1-genen med hjälp av CRISPR/Cas9-teknologi kan minska syntesen och ackumuleringen av hämmande biprodukter under produktionen av CHO-celler, och kommer inte att negativt påverka proliferationsförmågan hos CHO-celler. Specifik förstörelse av BAX-genen med CRISPR/Cas9-teknologi kan förlänga cellviabiliteten och öka spridningshastigheten. CRISPR/Cas9-systemet kan vara mer fördelaktigt i CHO-cellsgenmodifieringsprojekt och snabbt producera perfekta cellinjer med fördelaktiga egenskaper.