De huvudsakliga metoderna för att identifiera fosforylering är följande: a. In vitro fosforyleringsanalys: Radiometriska kinasreaktioner med 32P-gamma-ATP kan användas för att detektera fosforyleringsstatus in vitro; denna metod är semikvantitativ, men kan bestämma molekylvikten för fosforylerade proteiner. b. Radioaktiv pulsmärkning: För att detektera fosforylering in vivo kan radioaktiv pulsmärkning användas; celler odlas i närvaro av 32P-ortofosfat, och sedan immunoutfälls ett visst protein med en specifik antikropp. Radioisotopen som erhålls genom utfällning analyseras genom SDS-PAGE-elektrofores och kvantifieras genom röntgenfilmexponering. Denna metod kan detektera fosforylering under olika fysiologiska förhållanden. c. Fosforyleringsspecifika antikroppar: Det finns två kategorier av fosforyleringsspecifika antikroppar. Den första kategorin är en universell fosforyleringstyrosin/serin/treoninantikropp som kommer att binda till vilken som helst fosforylerad tyrosin, fosforylerad serin och fosforylerad treoninmolekyl, oavsett närliggande aminosyrarester; den andra kategorin av antikroppar är en fosforyleringsspecifik aminosyraepitopantikropp. Naturligtvis kan ovanstående metoder kombineras med datainsamlingsläge eller efter masspektrometri för att identifiera (förmodade) fosforyleringsställen, använd universella antikroppar för fosforyleringsställen för att avgöra om målproteinet är fosforylerat vid en specifik typ av plats genom immunoutfällning (IP) .
Glykosyleringsanalys kan utföras genom enzymatisk nedbrytning (såsom trypsindigestion) av proteinet som ska analyseras, följt av analys av glykopeptider med hjälp av vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS) eller hydrofil interaktionskromatografi-tandem masspektrometri (HILIC-MS/ MS) för att identifiera alla proteiner med specifika glykanmolekyler, eller glykanbindningsställena i målproteinet. Dessutom, för vissa glykopeptider, kan masspektrometri (MS) analys av intakta proteiner ge data om identifiering av proteinarter och deras glykosyleringsstatus, men med en lägre upplösning.
Sammanfattningsvis, även om metoderna för att identifiera proteinfosforylering och glykosylering är olika, kan båda analyseras med användning av masspektrometri, inklusive identifiering av fosforylerade/glykosylerade proteiner, fosforylerings-/glykosyleringsmodifieringsställen och modifieringsnivåer. Masspektrometri har också blivit en av de mest populära post-translationella modifieringsforskningsteknologierna på grund av dess överlägsna upplösning, noggrannhet och känslighet.