1. Använd rätt lagringsförhållanden för celler eller vävnader
Efter att provet snabbfrysts med flytande kväve bör det förvaras i -80 grad och får inte tinas. Även en kort upptining före homogenisering i en lysbuffert innehållande guanidinsalter kommer att orsaka RNA-nedbrytning och förlust. Snabbfrysta vävnader bör först malas till pulver under ultralåga temperaturförhållanden och sedan homogeniseras i lysbuffert.
RNAfixer gör provförvaring bekvämare. Celler eller vävnader som lagras i RNAfixer kan lagras stabilt i rumstemperatur i upp till 1 vecka, vid 4 grader i upp till 1 månad, eller permanent lagras vid -20 grad .
2. Eliminera miljömässig RNas-kontamination
För att erhålla intakt, högkvalitativt RNA är det viktigt att undvika att introducera ny RNas-kontamination under hela RNA-beredningsprocessen när RNA lämnar skyddet av starka proteindenaturanter (såsom kaotropisk lysbuffert eller fenol). Eftersom RNaser är nästan allestädes närvarande, är det nödvändigt att säkerställa att allt som kommer i kontakt med det renade RNA:t är RNasfritt. Alla ytor, inklusive pipetter, arbetsbänkar, glasvaror och geltillverkningsutrustning, måste behandlas med en ytdekontamineringslösning som RNase-sprayborttagningsmedel för att avlägsna RNase-kontamination som kan finnas i olika lösningar eller reaktionsbuffertar. RNAsafe kan användas. Det är nödvändigt att se till att RNase-fria pipettspetsar, provrör och lösningar alltid används, och handskar bör bytas ofta.
3. Inaktivera snabbt endogena RNaser för att förhindra RNA-nedbrytning. Följande tre metoder kan effektivt inaktivera endogena RNaser: 1) Skörda prover med cellysbuffert innehållande kaotropisk vätska (såsom guanidinsalter) och homogenisera omedelbart. 2) Frys omedelbart in prover med flytande kväve. Det är värt att notera att vävnadsblocken måste vara tillräckligt små för att frysa i det ögonblick de sänks ned i flytande kväve för att säkerställa att RNaset omedelbart inaktiveras. 3) Placera omedelbart provet i RNAfixer flytande kvävefri RNA-provlagringslösning. Det är ett vattenhaltigt, icke-toxiskt uppsamlingsreagens som omedelbart kan stabilisera och skydda RNA i intakta, ofrossade vävnads- och cellprover. Nyckelpunkten är att vävnadsprovskivorna måste vara tillräckligt tunna (<0.5 cm) so that RNAfixer can quickly penetrate into the tissue block before RNase destroys RNA.
4. Välj rätt metod för cellväggsbrytning
Den grundliga homogeniseringen av celler eller vävnader är ett kritiskt steg för RNA-extraktion, vilket kan förhindra RNA-förlust och nedbrytning. Homogeniseringsmetoden bör väljas efter typen av celler eller vävnader. De flesta odlade celler kan placeras i en cellysbuffert och homogeniseras genom enkel vortexning; medan djurvävnader, växtvävnader, jäst, bakterier och svampar ofta kräver mer drastiska metoder, vanligtvis malning med flytande kväve. Till exempel kräver bakteriens cellvägg (särskilt Gram-positiva bakterier) lysozymnedbrytning för att uppnå grundlig cellys och maximal RNA-återvinning. När man extraherar jäst tillsätts ett cellväggsbrytande enzym för att hjälpa till att bryta cellväggen, och sedan används TRIpure eller RNApure för extraktion.
5. Undvik omvägar vid RNA-extraktion - hur man väljer det mest lämpliga RNA-extraktionsreagenset för olika material
De många befintliga RNA-isoleringsmetoderna kan göra det svårt att välja. För närvarande är den enklaste och säkraste metoden kolonnseparation, som RNApure, som är populär på grund av sin enkla funktion, korta tid och höga renhet. RNApure kräver inte DNA-enzym för att smälta DNA, vilket sparar tid och undviker RNA-nedbrytning, vilket ökar utbytet; jämfört med icke-kolumnseparation (som TRIzol), tar den bort proteiner och andra föroreningar rent, förbättrar renheten och är mycket lämplig för celler, vävnader och allmänna växter. Extraktion av växt-RNA är svårare att välja. Växt-RNA-extraktion påverkas av innehållet av fenol, polysackarider, proteinföroreningar och sekundära metaboliter. Generellt är renheten för TRIzol-extraktion inte hög, och många växter kan inte extraheras med TRIzol.
För närvarande kan du välja polysackarid- och polyfenolväxt-total-RNA-extraktionskit (påskliljor, paprika, morötter, majs, liljor, vete, tomater, blomkål, raps, etc.) och universellt växt-RNA-extraktionskit (lämplig för de flesta växtextraktioner, inklusive: olika kinesiska örtmediciner, växtfrön, äpplen, vindruvor, jordgubbar, bananer, longans, litchi, gräsmatta växter, tallar, granar, vit björk, lila kottar, coleus, julstjärna, oleander, gråtande fikon, violer, rosor , dahlior, morning glory, etc.); Det är värt att nämna att extraktion av RNA från blod (inklusive serum, plasma, cerebrospinalvätska, olika pinnprover eller andra prover med högt vätskeinnehåll) med TRIzol och lyseringsmetoder för röda blodkroppar inte är effektiv, eftersom lyseringsbuffert för röda blodkroppar inte innehåller RNas-hämmare, och RNA bryts lätt ned i denna process. Det rekommenderas att använda TRIpure LS (RP1101) eller total RNA-extraktionskit (RP4001), som är lämplig för RNA-extraktion i experiment med expressionsprofiler.
6. Utfällning av RNA med låg koncentration
Det renade RNA:t kan behöva koncentreras genom utfällning för att möta behoven hos vissa nedströmsapplikationer. Ammoniumacetat (NH4OAc) utfällning (tillsätt 0,1 volym 5M ammoniumacetat, 2-2,5 volymer vattenfri etanol och placera vid -20 grad i mer än 25 minuter) kan återhämta sig RNA väl. Om RNA med låg koncentration (ng/ml) behöver utvinnas kvantitativt, kan samfällning (såsom linjärt akrylamidglykogen, jäst-RNA) användas. Nukleinsyrasamutfällningsmedlet är linjär akrylamid. När RNA används för RT-PCR-analys kan linjär akrylamid och DNas-behandlat glykogen användas som idealiska medutfällare eftersom de inte innehåller DNA-kontamination. Högt glykogeninnehåll kommer att hämma PCR-reaktionen. Uppmärksamhet bör ägnas åt att kontrollera koncentrationen. Nukleinsyrasamutfällare har ingen effekt på PCR och blir förstahandsvalet för virusnukleinsyraextraktion. Jäst-RNA och obehandlat glykogen kommer att föra nukleinsyrakontamination till provet, vilket kan påverka resultaten av RT-PCR. Efter utfällning, var noga med att undvika överdriven uttorkning av RNA-fällningen, eftersom detta kan göra det svårt att återupplösas.
7. Hur man lagrar extraherat RNA
Om det endast är avsett för korttidsförvaring ska det återsuspenderade RNA:t placeras i -20 grad; om det är för långtidsförvaring ska det placeras i -80 grad . När du lagrar RNA kan du lägga till en liten mängd RNase-hämmare för att undvika RNA-nedbrytning, och RNA kan användas direkt för experiment nedströms. Om du vill lagra RNA under lång tid kan du lägga till RNAlong. Vi rekommenderar att RNA-lösningen delas upp i flera rör. Detta kommer att undvika upprepad frysning och upptining för att skada RNA och förhindra oavsiktlig RNas-kontamination.